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              細胞凍存與復蘇的技術原理和操作步驟

              更新時間:2022-02-18  |  點擊率:2542

              細胞凍存與細胞復蘇,是細胞培養過程中的常見工作。


              細胞凍存,是指將細胞貯存在超低溫環境中,使細胞暫時“冬眠"的技術,在需要的時候再進行復蘇。


              細胞復蘇,是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍,并使細胞重新恢復生長的技術。


              本文將為大家介紹細胞凍存與復蘇的技術要點和操作步驟。 


              細胞凍存篇


              凍存原則


              細胞凍存原則為“慢凍",即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。


              如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍,細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑(如DMSO、甘油)和在凍存盒中添加的異丙醇,都起到程序性降溫的作用。


              DMSO使用注意事項


              DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中,延緩溫度下降速度,減少細胞內冰晶的形成,從而起到保護細胞的作用。


              需注意的是,DMSO溶于培養基時,將釋放大量熱量,所以細胞凍存液需提前配制,不能直接將DMSO加入含有細胞的培養基中,避免燙傷細胞。


              另外,DMSO屬于致癌物質,使用時應戴好手套,規范操作。


              程序凍存液配方


              程序凍存液成分一般由基礎培養基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%,DMSO比例為5%~10%。根據普諾賽實驗室細胞培養經驗,推薦凍存液配比:55%基礎培養基+40%胎牛血清+5%DMSO,難養細胞可用90%胎牛血清+10%DMSO凍存。


              細胞凍存密度


              細胞凍存和復蘇過程中,不可避免會損失部分細胞,所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細胞復蘇存活率,推薦密度為100~300萬細胞/mL。


              凍存操作方法


              方法一:使用程序凍存盒 



              使用程序降溫盒是最-常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇,有些則不需要。


              降溫盒須恢復室溫后再使用。


              根據普諾賽實驗室細胞培養經驗,使用程序凍存盒凍存效果良好,沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三。


              操作步驟

              步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預冷

              步驟2:離心收集對數生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉速1200rpm或250g,時間3min)

              步驟3:用配制好的凍存液重懸細胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

              步驟4:凍存管放入凍存盒,凍存盒放入-80℃冰箱過夜(24h)

              步驟5:凍存管從凍存盒取出,轉移至液氮長期保存


              使用凍存盒操作示意圖

               ▲ 使用凍存盒操作示意圖


              方法二:使用無血清非程序凍存液 



              無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液,無需自己配制,無需降溫盒,大大提升了便捷性。


              但是,并非所有細胞都適用于這種凍存液,使用前必須做凍存測試,沒問題后再批量應用。


              操作步驟

              步驟1:從冰箱拿出無血清非程序凍存液,待用

              步驟2:離心收集對數生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉速1200rpm或250g,時間3min)

              步驟3:棄上清,加入適量無血清非程序凍存液,重懸細胞

              步驟4:按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

              步驟5:將凍存管直接移入-80℃冰箱中,24h后轉移至液氮長期保存


              使用無血清非程序凍存液操作示意圖

              ▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖


              方法三:手動梯度降溫 



              在沒有凍存盒或者非程序凍存液時,可以選擇手動梯度降溫。但手動梯度降溫不適用于所有細胞,且效果不穩定,同樣需要先做凍存測試。


              操作步驟

              步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預冷

              步驟2:離心收集對數生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉速1200rpm或250g,時間3min)

              步驟3:用配制好的凍存液重懸細胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

              步驟4:凍存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的順序放置


              手動梯度降溫操作示意圖

              ▲ 手動梯度降溫操作示意圖


              細胞復蘇篇


              細胞復蘇講究“快融",越快融化,細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜,但每一步都必須穩扎穩打,才能最大限度地提高復蘇存活率。


              細胞復蘇步驟


              步驟1:水浴鍋預熱至37℃備用


              步驟2:準備15mL離心管,并向其中加入適量培養基待用

              小貼士:離心管中加入2~9mL的培養基,比較難養的細胞,可適量增加培養基。


              步驟3:將細胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴鍋

              小貼士:如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(步行超過1min),要把細胞先置于干冰上,再送至水浴鍋。如果將細胞凍存管直接放在手上或口袋里,可能導致溫度逐漸回升而產生冰晶損傷細胞。而將細胞凍存管裝在PE手套中,是為了預防污染。


              步驟4:用力搖晃凍存管,使其在1分鐘內融化

              小貼士:這一步越快融化越好,最好能放計時器在旁邊。如果1分鐘內沒有融化,可能是凍存液量偏多,或者搖晃力度不夠。


              步驟5:用紙巾擦拭水漬,轉移至生物安全柜。用移液槍吸取細胞懸液,緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管


              小貼士:當同時復蘇多管細胞時,注意不要弄混。


              步驟6:1200rpm離心3分鐘

              小貼士:離心是為了去除DMSO,對于DMSO敏感的細胞,必須離心;若復蘇的細胞對DMSO不敏感,步驟6、步驟7可以省略,直接將培養基補足至10mL,接種至培養器皿中,第二天換液。


              步驟7:棄上清,用新鮮培養基重懸細胞,接種至新的無菌培養器皿中

              細胞復蘇操作示意圖

              ▲ 細胞復蘇操作示意圖


              做完步驟7,細胞就復蘇好了。復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態,復蘇后的細胞密度低于80%時,48小時內不要換液,待細胞形態、生長速度等恢復正常,再進行細胞傳代等操作。(不要因為復蘇后兩三天細胞狀態不好就丟棄,應耐心等待至少一周。)


              當然,細胞復蘇后狀態很好的情況下,可以提前開始后續的細胞培養實驗。


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