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              細胞學堂 | 如何解決bEnd.3細胞形態變化、難消化

              更新時間:2023-05-23  |  點擊率:531

              bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內皮細胞)是從來自患有內皮瘤的小鼠腦組織中分離的內皮細胞,該細胞通過表達多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體感染而轉化。在培養時,bEnd.3細胞最常遇到的問題就是細胞形態變化和難消化,本期細胞學堂將幫您逐一解決。




              細胞形態問題




              bEnd.3細胞本身生長較慢,在低密度時會呈現不規則細胞形態,高密度時則呈規則纖維狀,所以若在培養過程中發現細胞形態異常,則有可能是細胞密度低,建議細胞鋪滿密度較高時傳代。以下為bEnd.3細胞不同密度培養圖片:


              圖片

              低密度(100倍鏡)


              圖片

              中密度(100倍鏡)


              圖片

              高密度(100倍鏡)





              消化問題




              消化時間

              bEnd.3細胞培養時間越長越難消化,培養4天傳代,一般消化3-5分鐘;培養7天傳代,一般消化5-10分鐘。具體消化時間以顯微鏡下觀察細胞狀態為準。


              圖片

              培養7天,消化5分鐘顯微圖


              圖片

              培養7天,消化10分鐘顯微圖




              難消化問題

              如遇到消化困難不必擔心,可通過分次消化的方式解決,具體操作方法如下(以T25瓶細胞為例):

              01

              吸出原培養液;

              02

              加入2mL左右PBS,輕輕晃動培養瓶潤洗細胞,吸出PBS丟棄;

              03

              加入1mL左右胰酶,輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有細胞;

              04

              放入培養箱消化,消化3-5分鐘(根據具體細胞稍作延長或縮短),顯微鏡下看到細胞開始漂浮,可以加入2mLPBS,晃動培養瓶使細胞懸浮,不要吹打剩下的貼壁細胞;

              05

              吸出培養瓶內的PBS和細胞懸液,轉移到無菌離心管中,在離心管中加入3mL含血清的培養基終止消化并吹散細胞,使細胞盡量呈單顆細胞的懸浮液;

              06

              原培養瓶中加入0.5mL胰酶,晃動培養瓶浸潤細胞,放入培養箱繼續消化,直到細胞塊中間全部收縮變圓,晃動培養瓶可脫落;

              07

              用3mL含血清的培養基終止消化,將瓶底的細胞全部吹下,并輕輕吹吸分散細胞呈單顆;

              08

              收集細胞懸液與第一次消化下來的細胞合并到一個離心管;

              09

              離心收集細胞沉淀,1200rpm/min 3分鐘,離心完吸出上清丟棄;

              10

              加入新鮮培養基,吹打幾下混勻細胞,按需接種到新培養瓶,補足培養基,擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養;

              11

              檢查培養箱二氧化碳,溫度和水盤。





              培養小貼士





              01

              圖片


              細胞培養過程中形態多樣,低密度時容易出現放射狀細胞,看似已經鋪滿瓶底,其實細胞量較少,需要細胞胞體排列緊密的時候進行傳代;

              02

              圖片


              細胞培養過程中避免頻繁換液,可以每隔2-3天換液或者半量換液一次;

              03

              圖片


              培養過程中會產生10%左右活的單顆漂浮細胞,貼壁細胞密度偏低時,注意收集懸浮細胞,貼壁細胞密度偏高時,可以換液時丟棄;

              04

              圖片


              接種量對細胞生長有影響,接種量過低細胞會有增殖緩慢,漂浮過多的現象,請注意控制傳代比例;

              05

              圖片


              細胞對溫度和pH較敏感,傳代或換液前培養基可以常溫復溫4小時以上;避免使用pH改變(偏酸:顏色偏黃;偏堿:顏色偏紫紅)的培養基;

              06

              圖片


              細胞傳代過程中若出現單次消化時間過長,可進行分次消化,切不可將細胞強行吹下來,以避免吹打造成細胞機械損傷。




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